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WI-38 [WI38]人胚胎肺成纤维细胞的应用!
dublicredits.com  2021-05-20 12:00  北京百欧博伟生物技术有限公司

WI-38 [WI38]人胚胎肺成纤维细胞的应用!


一、背景


WI-38[WI38]人胚胎肺成纤维细胞LeonardHayflick建系有限传代细胞系寿命为50±10代(倍增时间24h)来自妊娠3个月的正常胚胎肺组织。该细胞系用于人疫苗制备的人二倍体细胞,培养基中添加TNFα可以加快细胞生长。


二、WI-38人胚肺成纤维细胞培养步骤:


1)复苏细胞:将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟弃去上清液补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入6cm皿中)培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。


2)细胞传代:如果细胞密度达80%-90%, dublicredits.com即可进行传代培养。


对于贴壁细胞传代可参考以下方法:


1、弃去培养上清用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。


2、加1-2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中置于37℃培养箱中消化1-2min然后在显微镜下观察细胞消化情况若细胞大部分变圆并脱落迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。


3、轻轻吹打细胞完全脱落后吸出在1000RPM条件下离心8-10分钟弃去上清液补加1-2mL培养液后吹匀。


4、按5-6ml/瓶补加培养液将细胞悬液按1:2到1:5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。


三、应用


用于人Sox2和Nanog基因克隆及其对胎肺成纤维细胞分化的影响研究:


选取胎儿肺间质成纤维细胞作为宿主细胞,将测序成功的重组质粒pSG5-Sox2及pSG5-Nanog转染上述宿主细胞,观察干细胞相关基因Sox2和Nanog对于终末分化的体细胞形态及功能是否产生影响。


克隆人Sox2、Nanog基因编码序列,构建pSG5-Sox2及pSG5-Nanog真核表达重组质粒。原代培养胎肺间质成纤维细胞并传代作为宿主细胞,转染重组质粒pSG5-Sox2、pSG5-Nanog后检测目的基因表达,观察并鉴定宿主细胞分化方向。


方法:


1、应用RT-PCR方法分别从4-6周龄流产胎儿脑组织和膀胱癌细胞中扩增出Sox2及Nanog基因编码全序列,琼脂糖凝胶电泳鉴定。


2、目的基因片段Sox2及Nanog双酶切纯化后将其分别连接到pSG5表达载体,构成重组质粒pSG5-Sox2、pSG5-Nanog,转化、扩增后进行菌落PCR和双酶切鉴定后测序及序列比对。


3、原代培养胎肺成纤维细胞并传代,实验组将重组质粒pSG5-Sox2及pSG5-Nanog用FuGENE HD转染试剂转染胎肺成纤维细胞,以空质粒pSG5用上述方法转染细胞作为空白对照,未转染细胞加入等量的低糖DMEM培养基作为阴性对照,倒置显微镜观察转染前后的细胞形态学变化。


4、转染48h后,将3组胎肺成纤维细胞在六孔板中进行爬片,采用RT-PCR方法,免疫细胞化学检测Sox2及Nanog基因表达情况。过表达重组质粒,15-30d后进行角蛋白(广谱),巢蛋白,胶质纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇化酶免疫细胞化学染色,利用免疫反应对细胞中相应蛋白的表达进行定位。


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